">
Прикладные науки Биология
Информация о работе

Тема: изменение состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики

Описание: Общая характеристика и значение различных путей программируемой клеточной гибели. Некроз. Аутофагия. Ороговение. Молекулярные механизмы путей и гены программируемой клеточной гибели. Окислительный стресс. Антиоксидантная система. Роль флованоидов.
Предмет: Прикладные науки.
Дисциплина: Биология.
Тип: Курсовая работа
Дата: 16.08.2012 г.
Язык: Русский
Скачиваний: 36
Поднять уникальность

Похожие работы:

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра биотехнологии

КУРСОВАЯ РАБОТА

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ЛИПИДОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ГОЛУБЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И АНТОЦИАНОВ СМОРОДИНЫ И ЕЖЕВИКИ

Автор курсовой работы ___________________

Специальность 240901 Биотехнология

Обозначение курсовой работы КР-02069964-240901-08-12

Руководитель работы

канд. биол. наук, доцент ___________________

Оценка

Саранск

2012

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра биотехнологии

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ

Студент

1 Тема Изменение состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики

2 Срок представления работы к защите_________________________

3 Исходные данные для научного исследования литературные данные

4 Содержание курсовой работы

4.1 Введение

4.2 Аналитический обзор

4.3 Материалы и методы исследования
4.4 Результаты и их обсуждение
4.5 Выводы
4.6 Список использованных источников

Руководитель работы ____________

Задание принял к исполнению ____________

Реферат

Курсовая работа содержит 41 страницу печатного текста, 5 рисунков, 2 таблицы, 35 использованных литературных источников, из них 12 иностранных.

ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТКИ И ЕЕ ФОРМЫ, ИНДУКТОРЫ, АНТОЦИАНЫ, ПЕРИКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ФОСФОЛИПИДЫ

Объектом исследования являются липиды мембран эритроцитов голубя

Цель работы – изучить изменение состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики.

В процессе практики использовались методы экстракции и тонкослойной хроматографии.

Содержание

Обозначения и сокращения5

Введение6

1 Аналитический обзор7

1.1 Общая характеристика и значение различных путей программируемой

клеточной гибели 7

1.1.1 Молекулярные механизмы путей и гены программируемой

клеточной гибели13

1.2 Окислительный стресс18

1.3 Антиоксидантная система19

1.3.1 Роль флавоноидов как антиоксидантов20

2 Материалы и методы исследования23

2.1 Объект исследования23

2.2 Методы исследования23

2.2.1 Выделение флавоноидов23

2.2.2 Разделение флавоноидов методом ТСХ24

2.2.3 Микроскопия25

2.2.4 Выделение общих липидов по методу Блайя-Дайера25

2.2.5 Тонкослойная хроматография липидов26

2.2.6 Количественное определение фосфолипидов28

2.2.7 Статистическая обработка результатов28

3 Результаты и их обсуждение30

3.1 Изменение фосфолипидного состава мембран эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов ежевики30

3.2 Изменение фосфолипидного состава мембран эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов ежевики34

Выводы37

Список использованных источников38

Обозначения и сокращения

АОС – антиоксидантная система

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

АФ - аутофагосомы

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛФХ – лизофосфотидилхолин

НК – нуклеиновые кислоты

НП – нитропруссид натрия

ПОЛ – перекисное окисление липидов

РНК – рибонуклеиновая кислота

CMА - шаперон - ассоциированная аутофагия 

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФИ – фосфатидилинозитол

ФС – фосфатидилсерин

ФХ – фосфатидилхолин

ФЭА – фосфатидилэтаноламин

Введение

Регуляция процесса клеточной гибели является одной из центральных проблем биологии клетки и интенсивно изучается сейчас во всем мире. Интенсивность исследований в этой области не ослабевают, поскольку решение проблемы увеличения срока жизни клетки имеет прямое отношение к поддержанию гомеостаза многоклеточного организма и, следовательно, к биомедицинским задачам коррекции этого процесса в случае различных заболеваний. Известно, что запуск программы, ведущей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей. При действии подобных факторов на клетку, в ней запускается множество сигнальных путей, ведущих к нейтрализации последствий их отрицательного воздействия или, в случае непоправимого ущерба, к гибели клетки. Такая гибель поврежденных клеток происходит по пути программируемой клеточной гибели. В противовес клеточной гибели природе существуют вещества защищающие клетки от действия различных факторов (свободных радикалов) – антиоксиданты. К антиоксидантам относятся многие вещества такие как витамины С, Е и В, ряд аминокислот, флавоноиды.

Целью данной работы было исследование изменения состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики. В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

выделить и идентифицировать антоцианы из смородины и ежевики;

изучить влияние окислительного стресса на состав липидов клеток эритроцитов голубя;

изучить влияние антоцианов на состав липидов клеток эритроцитов голубя при окислительном стрессе.

1 Аналитический обзор

1.1 Общая характеристика и значение различных путей программируемой клеточной гибели

В основу классификации клеточной гибели могут быть положены морфологические проявления (апоптотическая, некротическая, аутофагическая и др.), биохимические критерии (с участием или без участия нуклеаз, таких, как каспазы, кальпаины, катепсины и трансглутаминазы), функциональные аспекты (запрограммированная или спонтанная, физиологическая или патологическая), а также иммунологические характеристики (иммуногенная или неиммуногенная) [1].

Апоптоз. Предположительно, апоптоз эволюционно возник у прокариот и закрепился у одноклеточных эукариот, в качестве механизма противовирусной защиты популяций. В дальнейшем, с появлением многоклеточных организмов, механизм программируемой клеточной смерти совершенствовался и был приспособлен, наряду с защитой от патогенов, для реализации важных жизненных функций:  дифференцировки клеток и тканей при эмбриогенезе и постэмбриональном развитии; элиминирования клеток иммунной системы, невостребованных, состарившихся клеток либо клеток, подвергшихся воздействию мутагенных факторов[2].

Морфологическими проявлениями апоптоза являются округление клетки, сокращение ее псевдоподий, снижение объема всей клетки и ее ядра (пикноз), конденсация хроматина, фрагментация ядра, пузырчатость цитолеммы, поглощение клетки резистентными фагоцитами. Изменения ультраструктуры цитоплазматических органелл при этом, как правило, незначительны или отсутствуют; целостность цитоплазмы сохраняется до последних стадий процесса (рисунок 1.1,а). Следовательно, термин «апоптоз» должен быть применим исключительно к таким событиям гибели клеток, которые имеют место при несомненном проявлении нескольких из этих морфологических признаков [3].



а – апоптоз опухолевой клетки глиомы головного мозга крысы.?12000; б – некроз клетки K562 (линия эритромиелолейкоза человека).?15000; в – аутофагия с образованием аутофагосомы (АФ) в эпителиоците слизистой оболочки тонкой кишки крысы в зоне слущивания.?60000; г – ороговение кератиноцитов с образованием кератогиалиновых гранул и пластинчатых телец, содержащих липиды (указаны стрелками). ?14000

Рисунок 1.1 - Ультраструктурные проявления основных типов клеточной гибели

Биохимическими признаками апоптоза принято считать: активацию

проапоптотических белков семейства Bcl-2,активацию каспаз, изменение проницаемости мембран митохондрий, олигонуклеосомальную фрагментацию ДНК, проявление ФС на внешней стороне цитолеммы, ее разрыв, накопление короткоцепочечной ssДнк [3].

Итак, термин «апоптоз» несет в себе значительную степень биохимической и функциональной гетерогенности. Имеется несколько подтипов апоптоза, которые обладая морфологически сходными признаками, могут запускаться по различным биохимическим путям (например, «внешний» и «внутренний», с участием митохондрий или без, каспазависимый или каспанезависимый и т.д.). Во многих случаях ингибирование каспаз просто вызывает сдвиг морфологической картины гибели клеток с апоптотической к смешанной и даже к резко выраженным формам некроза или аутофагической клеточной смерти.

Некроз. Некротическая клеточная гибель, или некроз, представляет собой морфологически охарактеризованный тип гибели клеток, при котором наблюдается увеличение объема клетки, умеренная конденсация хроматина, набухание органелл с разрывом цитолеммы и последующей утратой внутриклеточного содержимого (рисунок 1.1, б). В течение длительного времени некроз рассматривали как случайную, неконтролируемую форму клеточной смерти, однако к настоящему времени накопились свидетельства того, что некротическая гибель может быть программируемой. Так, показано, что рецепторы домена смерти (например, TNFR1, Fas/CD95,TRAIL-R) и Toll-подобные рецепторы (например, TLR3 и TLR4) способствует возникновению некроза, в частности в присутствии ингибиторов каспаз или при ингибировании киназы RIP-1 с помощью так называемых некростатинов – небольших пептидных молекул. Некоторые авторы предлагают термин «некроптоз» для обозначения регулируемого (противоположность случайному) некроза [5].

К биохимическим маркерам некроза можно отнести падение уровня АТФ в клетке, высвобождение провоспалительного цитокина HMGB-1, увеличение проницаемости митохондриальных и лизосомальных мембран, избыточное образование активных форм кислорода, возрастание концентрации кальция в цитозоле, приводящее к перегрузке митохондрий и активации некаспазных протеаз. В случаях регулируемой некротической смерти клеток показана ведущая роль серин-треониновой киназы RIP-1. До сих пор, однако, не существует единичного мнения о том, какие биохимические критерии могут быть использованы для однозначной идентификации некроза.

Аутофагия. Сегодня в центре внимания специалистов в области клеточной биологии оказался еще один процесс — аутофагия (аутофагоцитоз). Ее подразделяют на макроаутофагию, микроаутофагию и шаперон - ассоциированная аутофагия (CMA) [6].

Морфологически аутофагическая клеточная гибель определяется как тип смерти клетки, происходящей при отсутствии конденсации хроматина, но сопровождающейся массированной аутофагической вакуолизацией цитоплазмы. В противоположность апоптозу клетки, которые погибают с морфологическими признаками аутофагии, не ассоциированы с фагоцитами. Макроаутофагия характеризуется секвестрацией цитоплазматического материала в аутофагосомы и является более изученным типом аутофагии. Аутофагосомы, по определению, являются двумембранными структурами, которые содержат разрушающиеся цитоплазматические органеллы и/или цитозоль, что позволяет отличить их при помощи трансмиссионной электронной микроскопии от других типов везикул, таких, как эндоспоры, лизосомы или апоптотические пузырьки (рисунок 1.1,в). Аутофагосомы помогают к летке избавляться от хлама — продуктов неправильного соединения обычных белков или белков, выработавших свой ресурс. Такие белки либо перестают функционировать, либо, что гораздо хуже, функционируют неправильно, и от них необходимо как можно скорее избавиться. Непрерывно работающая система аутофагии поддерживает концентрацию таких белков на безопасном уровне [7].

Аутофагосомы не только удаляют аномальные белки, но и отыскивают и изолируют поврежденные органеллы. Так, митохондрии, в норме обеспечивающие клетку энергией, могут посылать ей несвоевременные сигналы к запрограммированной гибели — апоптозу [8].

Не так хорошо изученным является следующий тип аутофагии - микроаутофагия. При микроаутофагии, как при образовании мультивезикулярных телец, образуются впячивания мембраны эндосомы или лизосомы, которые затем отделяются в виде внутренних пузырьков, только в них попадают вещества, синтезированные в самой клетке. Таким путем клетка может переваривать белки при нехватке энергии или строительного материала (например, при голодании). Но процессы микроаутофагии происходят и при нормальных условиях и в целом не избирательны. Иногда в ходе микроаутофагии перевариваются и органоиды; так, у дрожжей описана микроаутофагия пероксидом водорода и частичная микроаутофагия ядер, при которой клетка сохраняет жизнеспособность. Этот механизм также является путём деградации органелл и долгоживущих белков, но, в отличие от макроаутофагии, он не отвечает за адаптацию к недостатку питательных веществ[10].
Третий тип самопоедания является  шаперон -ассоциированная аутофагия (CMA) (рисунок 1.2). Несмотря на то, что этот путь также чувствителен к недостатку питательных веществ, в нём не происходит тотального поглощения органелл или избирательного распознавания субстрата. В CMA, белки цитоплазмы, которые содержат конкретные пента-пептидные мотивы, распознаваемые лизосомами (консенсус последовательность KFERQ) распознаются комплексом белков-шаперонов (в том числе теплового шока 73 кДа-белок, hsc73) и направляются к лизосомной мембране, где они взаимодействуют с белками, связанными с мембраной лизосом (LAMP). Пока еще не ясно как KFERQ мотив распознается шапероновым комплексом. Некоторые посттрансляционные изменения субстратов (например, окисление или денатурация) могут сделать этот мотив более доступными для шаперонов, повышая уровень их лизосомного поглощения в CMA [11].



Рисунок 1.2 - Макроаутофагия, микроаутофагия  и шаперон-зависимая аутофагия

Ороговение. Ороговение или кератинизация, - это специфическая форма программируемой гибели клеток, которая имеет место в эпидермисе и морфологически и химически отличается от апоптоза. Ороговение приводит к образованию рогового слоя, состоящего из корнеоцитов – погибших кератиноцитов, содержащих специфические белки (кератины, лорикцин, инволюкрин и др.). Такая организация необходима для функционирования кожи: она обеспечивает такие ее свойства, как механическое сопротивление, эластичность, гидрофобность, структурная стабильность и др. Ороговение часто рассматривается как реализация программы терминальной дифференцировки, аналогичной той, которая существует в некоторых других тканях (хрусталиковые волокна, зрелые красные кровяные клетки).

На молекулярном уровне ороговение происходит в результате функционирования специфического механизма дифференцировки эпителиальных клеток, в ходе которой кератиноциты экспрессируют все ферменты и субстраты, необходимые для построения эпидермального барьера, позволяющего изолировать организм от окружающей среды. Эффект достигается: 1) путем перекрестного связывания трансглутаминазами 1, 3 и 5-го типов нескольких субстратов, таких, как лорикрин, кератин, инволюкрин; 2) путем синтеза специфических липидов, высвобождающихся во внеклеточное пространство, где они ковалентно связываются с белками ороговевшей оболочки и ограничивают проницаемость барьера; 3) путем синтеза протеаз, необходимых для дескваминации роговых пластов. Морфологическими признаками ороговения могут служить: элиминация органелл, накопление лорикнина и филаггрина соответственно в L- и F- кератогиалиновых гранулах, высвобождение липидов из ламеллярных телец во внеклеточное пространство и десквамация корнеоцитов путем активации протеаз (рисунок 1.1,г). Биохимическими критериями ороговения принято считать усиление экспрессии трансглутаминаз и их субстратов, а также усиление перекрестного связывания вышеуказанных белков [12].

1.1.1 Молекулярные механизмы путей и гены программируемой

клеточной гибели

В развитии программируемой клеточной гибели условно различают 3 фазы. Начальная фаза или фаза индукции, связана с ранними событиями, развивающимися без существенных изменений метаболизма и морфологии клетки, в результате которых принимается решение о самоуничтожении. Эта стадия лучше всего изучена на примере апоптоза, запускаемого лигандами, структура которых наиболее полно изучена на примере Fas-рецептора и рецептора фактора некроза опухали. В ответ на связывание с лигандом Fas-рецепторы образуют внутриклеточный кластер, состоящий из доменов «смерти». Эти домены в свою очередь взаимодействуют с белком, который затем регулирует активность специфического фермента (прокаспаза-8). В результате такой регуляции прокаспаза-8 претерпевает аутогидролиз с образованием активного фермента каспазы-8. установлено, что эффекторная каспаза-8 может активировать и другие каспазы (каспазу-3 и 7). Рассмотренные выше события составляют основу второй, или исполнительной фазы, после чего процесс становиться необратимым и клетка входит в 3 фазу – фазу самодеградации. Приводящая к гидролизу структурных белков клетки. Кульминацией можно считать активизацию  нуклеаз, когда начинается фрагментация геномной ДНК, что является биохимическим маркером апоптоза [13]. Это явление необратимо, оно продолжается до наступления изменений в клеточной проницаемости, что и приводит клетку к гибели. В большинстве клеток такую фрагментацию ДНК вызывают кальций и магний-зависимые ядерные эндонуклеазы, которые избирательно «разрезают» ДНК на отрезки, локализованные между нуклеосомами (линкерные участки ДНК), и приводят к образованию моно- и олигонуклеосомных фрагментов ДНК. Процесс активации ферментов тонко регулируется и является АТФ-зависимым. Нуклеазной атаке подвергаются не только эухроматиновые (генетически активные), но и спирализованные уплотненные гетерохроматиновые участки. Для того, чтобы запустить этот процесс, клетка должна произвести ферменты – нуклеазы, что приводит к усилению процессов транскрипции (биосинтез РНК) и трансляции (биосинтез белка). Имеются данные, что ингибиторы белкового синтеза - циклогексамид и пуромицин - предотвращают энзиматический распад хроматина и могут предотвратить или отсрочить процесс апоптоза. Хлористый цинк также приводит к предотвращению фрагментации ДНК и отсрочивает апоптоз. Программируемая клеточная смерть может иногда приостанавливаться при ингибировании транскрипции или трансляции нуклеиновых кислот [14]. Это свидетельствует о том, что гибель клетки регулируется  клеточными механизмами.



Рисунок 1.3 - Этапы апоптоза трофобластической клетки: 1А - клетка сморщивается, теряя в течение нескольких минут до 1/3 своего объема; 1В - гетеро- и эухроматин, становится суперконденсированным, принимает форму полумесяца (подковы) по периферии ядра; 1С – продолжение сокращения клетки; 1D - появления специфических мембранных выпячиваний; стрелкой обозначено апоптотическое тельце

Отличительным морфологическим проявлением апоптоза является коллапс ядра. После получения сигнала, призывающего клетку подвергнуться апоптозу, в ней происходит целый ряд биохимических и морфологических изменений. В отличие от некроза, при апоптозе клетка сморщивается, теряя в течение нескольких минут до 1/3 своего объема ( рисунок 1.3, А). “Усыхание” хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным, принимает форму полумесяца (подковы) по периферии ядра (рисунок 1.3, В).

Клетки продолжают сокращаться (рисунок 1.3, C), принимая форму, удобную для фагоцитирования их макрофагами (или соседними клетками). Последние, в свою очередь, ответственны за удаление апоптотических клеток из тканей крайне «деликатным» способом. Изменения на уровне мембран клеток могут наблюдаться  морфологически в виде появления специфических мембранных выпячиваний (рисунок 1.3, D) или пузырей, которые часто завершают апоптотический процесс. Небольшие пузырьки часто называют «апоптозными тельцами» [15].  Далее еще живые апоптозные тельца утилизируются, содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду и не вызывает воспалительных явлений. Таким образом, уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей и является более «деликатным» по сравнению с некротическим механизмом гибели.

Исследования продемонстрировали, что процесс апоптоза генетически детерминирован и регулируется следующими генами: усиление работы генов Cip1 (p21), Bax (p21), Daax, FAF-1, FADD, TRADD, RAIDD, RIP, SIVA, FLIP, CAS, TIA-1/TIAR, TDAG51 и др., белков p53, р21 ускоряет течение апоптоза, гены семейства Bcl-2, Bad, Bag1 препятствуют апоптозу [16]. Важен и тот факт, что после начального повреждения нередко включается некий триггерный механизм. Он приводит к тому, что каскадная гибель клеток может продолжаться даже после удаления первичного стимула нейронного апоптоза. Мнения исследователей по вопросу о факторах, индуцирующих апоптоз, представлены в литературе достаточно широко. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма -, рентген- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция  апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента может развиться некроз. «Неспецифичность» этих воздействий заключается в том, что они не имеют адресной мишени в клетке и индуцируют множественные поражения генома, белков или (и) вызывают биоэнергетическую катастрофу. Поскольку апоптоз - физиологическое явление, то в организме имеются и специфические факторы, приводящие к апоптозу клетки. К настоящему времени известно, что апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, так и внешние, сами по себе не являющиеся токсическими или деструктивными, и опосредующие свое действие через рецепторные системы. В целом, если идет речь о физиологических факторах, то, вероятно, следует применять термин регуляция апоптоза клетки, поскольку известна группа физиологических активаторов и ингибиторов апоптоза. Снижение производства энергии вызывает повышение активности кислорода и может стать пусковым механизмом развития апоптоза как в здоровых, так и в больных клетках [17]. Среди растущего числа выявленных пусковых механизмов апоптоза выделяются некоторые факторы, играющие в этом процессе ведущую роль. Выделены аминокислоты, избыток которых патологически повышает деполяризацию клеточной мембраны. Кроме того, в больших количествах они являются токсинами, что дает возможность признать их роль в происхождении многих неврологических нарушений. Повышение концентрации этих аминокислот приводит к накоплению калия, кальция и освобождению свободных радикалов внутри клеток. К физиологическим факторам, способным запускать в клетках апоптотическую программу, относится также оксид азота (NO) - одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечно- сосудистой, нервной и иммунной систем организма. Оксид азота участвует в нейротрансмиссии в центральной и периферической нервных системах [18]. S. Snyder, директор института нейробиологии J. Hopkins Medical School отметил: «За мои 25 лет работы в нейробиологии я не знал другую молекулу, которая так активно влияла бы на физиологические и патологические функции организма». В силу своих небольших размеров NO- молекула липофильна, способна проникать через мембраны клетки и реагировать с множеством биохимических мишеней, в том числе с гемогруппами, железными и цинковыми кластерами. Нарушение синтеза или регуляции количества NO способно воздействовать на множество важных биологических процессов и приводить к различным заболеваниям [19]. Доказана роль оксида азота в регулировании нейроапоптоза. При этом в зависимости от концентрации NO и типа клетки, оксид азота может как стимулировать апоптоз, так защищать клетку от смерти [20]. Выявлено, что окись азота способна также ингибировать апоптоз различных типов клеток: лейкоцитов, гепатоцитов,  эндотелиальных клеток. В больших концентрациях NO - мощный нейротоксин. Среди прочих факторов индукции апоптоза следует отметить увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и свободных радикалов - активных форм кислорода (АФК). Митохондрии играют важную роль в ПОЛ, как поставщик ряда апоптогенных факторов, в частности свободные радикалы (ОН-) [21].

1.2 Окислительный стресс

Окислительный стресс - один из наиболее значимых механизмов повреждения клетки, запускающий патологические реакции, которые необратимо повреждают клетку и приводят к запуску генетически запрограммированной гибели.

Следует отметить, что существование человека в условиях современной техногенной цивилизации неизбежно приводят к постоянному появлению стрессовых ситуаций, их накоплению и в конечном счете к развитию патологических изменений в различных органах и системах. Негативное влияние факторов окружающей среды (табачный дым, загрязнение воздуха выбросами транспорта и промышленных предприятий, радиационное и ультрафиолетовое излучение, ксенобиотики, в том числе лекарства, анестетики, пестициды, промышленные растворители и др.), чрезмерная физическая нагрузка, стресс, переутомление сопровождаются увеличением образования свободных радикалов.

Нарушение обмена веществ и энергии, накопление активных повреждающих агентов (свободных радикалов, прооксидантов, АФК), инициирующих повреждение клеток и ведущих к развитию различных патологических состояний, получило название оксидативного стресса. Его основу составляет свободнорадикальное окисление жирных кислот, или так называемое перекисное окисление липидов (ПОЛ) [22].

Окислительный стресс может быть следствием различных механизмов:

1) повышенного образования реактивных оксидантов, образующихся при окислении как самих углеводов, так и углеводов, образующих комплексы с различными белками, а также в результате аутоокисления жирных кислот в триглицеридах, фосфолипидах и эфирах холестерина;

2) снижения активности антиоксидантной системы в организме, которая представлена глютатионом, глютатионпероксидазой, каталазой, супероксиддисмутазой, витаминами К, Е, С, ?-липоевой кислотой и другими антиоксидантами (таурин, каротин, мочевая кислота и коэнзим Q10);

3) нарушения ферментов полиолового обмена глюкозы, митохондриального окисления, обмена простагландинов и лейкотриенов и снижения активности глиоксалазы [23].

1.3 Антиоксидантная система

В противовес свободнорадикальным процессам в организме существует антиоксидантная система (АОС), представляющая собой совокупность защитных механизмов клеток, тканей, органов и систем, направленных на сохранение и поддержание гомеостаза в организме.

Равновесие между этими двумя противоположными составляющими в состоянии физиологического оптимума удерживает перекисное окисление на определенном низком уровне, препятствуя развитию цепного окислительного процесса и характеризует антиоксидантный статус организма. Без его универсальной эндогенной системы защиты нормальное существование организмов в биосфере Земли в условиях загрязненной атмосферы, естественного радиационного фона и ультрафиолетового излучения Солнца было бы невозможным [24].

Различают ферментативные и неферментативные составляющие АОС. Ферментативное звено представлено глутатионпероксидазой, супероксиддисмутазой и каталазой. Они имеют определенную специализацию по отношению к конкретным видам радикалов и перекисей. Согласно имеющимся данным, активность глутатионпероксидазы уже на ранних стадиях сосудистой патологии головного мозга уменьшена почти вдвое по сравнению со здоровыми и имеет тенденцию к дальнейшему уменьшению по мере прогрессирования заболевания.

Неферментативное звено АОС состоит из соединений в которые входят витамины, так и флавоноиды [25].

1.3.1 Роль флованоидов как антиоксидантов

Флавоноиды вместе с другими полифенолами потенциально полезны для здоровья человека благодаря их антиоксидантным, антибактериальным, антивирусным, противовоспалительным и антиаллергическим свойствам.

Овощи, фрукты и зеленый чай - богатые источники полифенолов.

Все флавоноиды в той или иной степени обладают антиоксидантными свойствами. Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения. Находятся флавоноиды в различных органах, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах. Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 20% (в цветках софоры японской). Флавоноиды для человека полезны прежде всего тем, что они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях организма, способствуя выработке оксида азота [26].

Вплоть до недавнего времени роль оксида азота для организма была изучена плохо. Однако, в 1998 году Луи Игнаро,Ферид Мьюред и Роберт Фёрчготт были награждены Нобелевской премией по физиологии и медицине за установление функциональной роли этого соединения в работе сердечно-сосудистой системы. Итак, в результате исследований было выявлено, что оксид азота:

- способствует регуляции кровяного давления, что доказали и голландские ученые, изучая свойства шоколада;

- предотвращает окисление холестерина - причину образования тромбов, за что флавоноиды получили звание эффективных антиоксидантов;

- положительно воздействует на нервную систему и бронхи;

- укрепляет иммунитет.

Во многих фруктах и ягодах биофлавоноиды более или менее равномерно распределены в кожице и мякоти. Поэтому слива, вишня, смородина, облепиха, черника и др. имеют ровную окраску. В противоположность этому, в плодах некоторых других растений флавоноиды содержатся, в основном, в кожице, и, в меньшей степени, - в мякоти. А в яблоках, например, они имеются только в кожице[22].

Биологическая роль флавоноидов заключается в их участии в окислительно-восстановительных процессах, происходящих в растениях. Они выполняют защитные функции, предохраняя растения от различных неблагоприятных воздействий окружающей среды.

Многие флавоноиды обладают Р-витаминной активностью, уменьшают хрупкость кровеносных капилляров, усиливают действие аскорбиновой кислоты, оказывают седативное действие. Используются как противовоспалительное, противоязвенное средство. Некоторые - обладают кровоостанавливающими свойствами; применяются при геморрое; служат хорошими желчегонными средствами. В последние годы появились сообщения о противоопухолевом действии флавоноидов. Однако препаратов, содержащих чистые флавоноиды, пока имеется немного[23]. Чаще эти соединения находятся в растениях в комплексе с другими биологически активными веществами и используются суммарно. Лекарственными формами, содержащими флавоноиды, могут быть высушенные растительные ткани, экстракты из растительного сырья или флавоноидные комплексы, выделенные в чистом виде [27].

Антиоксидантная активность фенольных соединений объясняется двумя их особенностями. Во-первых, они связывают ионы тяжелых металлов (образуя с ними довольно прочные, яркоокрашенные и стабильные комплексы), которые являются катализаторами окислительных процессов. Так, например, соли свинца с флавоноидами образуют желтые или оранжевые комплексы. Ионы металлов катализируют свободное окисление органических соединений при доступе молекулярного кислорода. Флавоноиды, соединяя комплексообразующую способность с относительной безвредностью и малой токсичностью, тем самым ослабляют или выключают каталитическое действие свободных ионов тяжелых металлов.

Во-вторых, флавоноиды могут служить ловушкой для свободных радикалов, благодаря наличию активных гидроксильных групп, способных к комплексообразованию. От количества гидроксильных групп зависят индивидуальные антиоксидантные свойства - чем их больше, тем мощнее антиоксидант. Способность к обратимому окислению, свойственна далеко не всем флавоноидам. При расположении гидроксильных групп рядом (орто-положении) и напротив (пара-положении) легко образуются хиноны. А флавоноиды с наличием гидроксильных групп в мета-положении практически не окисляются, потому что при таком расположении гидроксилов невозможна перестройка электронной структуры.

Таким образом, флавоноиды играют роль антиоксидантов - веществ, которые предупреждают неферментное перекисное окисление органических соединений. Одними из самых сильных антиоксидантов являются: кверцетин, пикногенол, рутин и гесперидин [28].

2 Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

Объектом исследования служили антоцианы, выделенные из черной смородины (Ribеs nigrum), ежевики (Rubus) и эритроциты крови голубя (Columba livia).

Для исследования использовали кровь, стабилизированную гепарином. Инкубацию крови проводили в пластиковых пробирках следующим образом: помещали в пробирки по 3 мл стабилизированной крови, приливали водный раствор цианистого калия до концентрации 10 мМ, перикисное окисление липидов индуцировали препаратом «нитропруссид натрия» до концентрации 20 мМ, ингибировали ПОЛ добавлением 30% водно – спиртового раствора выделенных флавоноидов до концентрации 0,0025мг/мл. Пробирки помещали в термостат при температуре 250С при постоянном перемешивании. Отбор аликвот крови проводили через 12 и 24 часа после воздействия индуктора и ингибитора.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение флавоноидов

Для выделения флавоноидов использовали плоды чёрной смородины. 5 г измельчённых плодов помещали в колбу и заливали 50 мл 70% этилового спирта. Экстракцию проводили на водяной бане с обратным холодильником двукратно по 45 минут. Полученные экстракты объединяли [29].

Кумарины, мешающие количественному определению флавоноидов, извлекали из водно–спиртовой фракции хлороформом [30]. Для этого к 5 мл водно-спиртового раствора приливали 2,5 мл хлороформа и центрифугировали 15 минут при 3000 оборотах. Происходило разделение раствора на две фракции: верхнюю – кумарины и хлороформ и нижнюю – водно-спиртовой раствор флавоноидов. Нижнюю часть отбирали и выпаривали на водяной бане до постоянного веса. Полученные флавоноиды растворяли в 70% этиловом спирте до концентрации 40 мг/мл.

2.2.2 Разделение флавоноидов методом ТСХ

Для разделения флавоноидов использовали хроматографическую камеру. Стенки камеры выстилали изнутри фильтровальной бумагой, которая пропитывается растворителем, чтобы ускорить ее насыщение парами системы растворителей.

Использовали систему растворителей Х:М (хлороформ – метанол) 8:3[31]. камеру готовили по крайней мере, за 1 час до проведения хроматографии, для этого в нее заливали достаточное количество растворителя, толщина слоя системы растворителей составляла около 1-1,5 см. Обязательным условием хроматографирования является герметичность камеры. В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Образцы, предназначенные для разделения, наносим на расстоянии 0,5 – 1,5 см от краев пластины. Образцы наносили микрошприцем фирмы «Hamilton» (США) по 30 мкл в виде полосы (одномерное разделение) на алюминиевые пластинки «Silufol» с тонким слоем силикагеля. В качестве свидетеля использовали 1% раствор свидетеля.

После полного испарения растворителя из нанесенных образцов, пластины помещали в хроматографическую камеру. Разделение заканчивали, когда фронт растворителей не доходил до верхнего края пластинки на 0,5 см. Пластинку вынимали из камеры и высушивали в токе холодного воздуха до исчезновения запаха растворителей.

2.2.3 Микроскопия

Для приготовления мазков на чистое предметное стекло наносят небольшой каплей кровь из пробирки. При помощи стекла с отшлифованным краем готовят мазок. Окраску проводят Эозином метиленовой сини по Май - Грюнвальду. краситель Эозина метиленовой сини по Май – Грюнвальду представляет собой 0,25% раствор сухого красителя, являющегося смесью азура с метиленовым голубым в соотношении 1:5 в метаноле. Его наливают на нефиксированный препарат так, чтобы он покрыл весь мазок крови и через 2 – 3 минуты добавляют при тщательном перемешивании двойное количество фосфатно-буферного раствора. Буфер готовят следующим образом: на аналитических весах взвесить навеску 17,838 г. натрия фосфорнокислого двузамёщенного и растворить 1000 мл дистиллированной воды. На аналитических весах взвесить навеску 13,614 г. калия фосфорнокислого однозамещенного и растворить 1000 мл дистиллированной воды. К 100 мл дистиллированной воды прилить 0,5 мл натрия фосфорнокислого двузамещённого и 0,5 мл калия фосфорнокислого однозамещенного. pH полученного раствора должен быть 6,8 – 7,0.

После добавления фосфатно-буферного раствора препарат окрашивают 5 - 10 минут. После окраски препарат промыть дистиллированной водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

2.2.4 Выделение общих липидов по методу Блайя-Дайера

Для получения эритроцитарной массы эритроциты трижды промывали физиологическим раствором с последующим центрифугированием в течение 15 мин. при 3000 об/мин.

Готовили гомогенизат, состоящий из хлороформа, метанола и воды (1:2:0,8 по объему) и добавляли его к 0,5 мл эритроцитарной массы, оставляли на экстракцию в течении 1 часа. Для разделения нелипидных водорастворимых примесей в полученную смесь добавляли ? мл хлороформа и ? мл воды от общего объема, вытряхивали и оставляли на 10 – 12 часов или центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. В этих условиях происходит деление раствора на 2 фазы: верхняя-водно-метанольная, содержит водорастворимые компоненты, на границе фаз – белая пленка – протеолипиды, и нижняя – хлороформная, содержит липиды. Нижнюю фазу осторожно отделяли и сливали в предварительно взвешенную выпаривательную колбу.

Конечный экстракт в выпаривательной колбе упаривали на роторном испарителе «ROTADEST» (Венгрия), затем высушивали в токе охлажденного азота до постоянного веса. Полученные липиды растворяли в смеси хлороформ- метанол (2:1 по объему) до концентрации 20 мг/мл.

2.2.5 Тонкослойная хроматография липидов

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили в тонком слое силикагеля, нанесенного на стеклянную пластинку. Применяли силикагель марки КСК (Вознесенск). В качестве связующего компонента использовали гипс.

Для приготовления ТСХ пластин стеклянную подложку промывали хромовой смесью, водой, а затем дистиллированной водой. Готовили навеску силикагеля 10 г, добавляли 1 г гипса растворяли ее в 33 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут. Далее ее наносили на установленную по уровню пластинку и оставляли до застывания.

1 2